seneff@csail.mit.edu
18. elokuuta 2019

Antoniou et ai. Julkaisi äskettäin paperin. lihavoidulla otsikolla “Glyfosaatti ei korvaa glysiiniä proteiineissa, jotka jakavat aktiivisesti nisäkässoluja”. [1]. Lehdessä paljastettiin ihmisen rintasyöpäsolut glyfosaatilla kuuden päivän ajan, ja sitten käytettiin kehittynyttä tekniikkaa, nimeltään Tandem massalappu (TMT) leimaamista, lyhyiden peptidien tunnistamiseksi, joiden väitetään sisältävän poikkeavasti raskaat glysiinimolekyylit. Sekä käsiteltyjen että käsittelemättömien solujen proteiinit pantiin läpi standardimenetelmällä, joka sisälsi massaspektrometrian, osittaisen proteolyysin ja lisäanalyysin, kuten paperissa yksityiskohtaisesti selitetään.

Soluja ylläpidettiin rikkaalla ravitsemuksellisella formulaatiolla, jota kutsuttiin Dulbeccon modifioiduksi kotkaväliaineeksi. Tämä formulaatio on muunnos alkuperäisestä keskikokoisesta kotkasta, joka on nelinkertaisesti rikastettu aminohapoilla ja vitamiineilla. Sillä on myös korkea glukoosikonsentraatio pitoisuudessa 4500 mg/L. Ei ole takuuta, että se ei ole saastunut glyfosaatilla. Lisäksi soluja oli kasvatettu viljelmässä jo jonkin aikaa määrittelemätöntä aikaa, ja todennäköisesti niihin oli kertynyt huomattavia määriä väärin laskostettuja glyfosaatin saastuttamia proteiineja, joita oli vaikea poistaa. He luultavasti aloittivat elämänsä kulttuurissa jo glyfosaatin saastuttamilla proteiineilla elämän ajanjakson altistumisen kautta glyfosaatille ihmiselle, joka alun perin oli saanut näitä soluja rintarauhaskasvaimesta.

Kirjoittajat testasivat näytteitä kahden erilaisen translaation jälkeisen modifikaation (PTM) suhteen: glyoksylaattimodifioidusta kysteiinistä ja glysiinisubstituutiosta glysiinille. He sisällyttivät glyoksylaattimodifikaation, koska he oletsivat, että glyfosaatti voisi hajota glyoksylaatiksi, joka kykenee sitoutumaan kysteiinitähteisiin. Erityisesti he eivät havainneet glyoksylaatilla modifioituja kysteiinejä joko kontrollisoluissa tai käsitellyissä soluissa.

Sitä vastoin tekijät löysivät merkittävän signaalin glyfosaatin läsnäololle useissa lyhyissä peptideissä käsitellyissä näytteissä. He löysivät kuitenkin myös yhtä voimakkaan signaalin käsittelemättömistä näytteistä. He kirjoittivat: “Tässä kokeessa kummankaan mielenkiintoisen oletetun PTM: (translaation jälkeiset modifikaatiot) ei kuitenkaan odoteta olevan läsnä glyfosaattikäsittelyn puuttuessa. Siksi oli mahdollista käyttää TMT-merkintöjä mahdollisten identifioimiseksi ja suodattamiseksi. mahdolliset väärät löytöt.” Ja sitten: “Tiedot osoittavat lopullisesti, että kaikki ehdokaskorvatut peptidit ovat vääriä löytöjä.”

Yhtä todennäköinen argumentti on kuitenkin, että “käsittelemättömissä” soluissa on myös glyfosaattisubstituoituja proteiineja. Mahdollisesti suurin osa, elleivät kaikki, ehdolla substituoidut peptidit ovat todellisia löytöjä. Koska sekä käsitellyt että kontrollisolut olivat olleet glyfosaatin kanssa alttiina jo pitkään aikaisemmin, on uskottavaa, että ne molemmat olivat keränneet glyfosaatin saastuttamia proteiineja lähes yhtä suuressa määrin. Anthony Samsel ja minä keskustelimme ensimmäisessä glysiinin korvaamisen glyfosaattisessa artikkelissamme todisteista siitä, että N-substituoidut glysiinit voivat muodostaa peptoideja, joita on erittäin vaikea hajottaa, ja että fosfonaateilla on osoitettu kyky estää proteolyysiä [2].

Ajatusta siitä, että glyfosaattialtistus johtaa proteolyysiresistenssien proteiinien kertymiseen, tukee vuonna 2013 julkaistu hernekasveista tehty tutkimus [3]. Kirjoittajat havaitsivat ubiquitinoitujen proteiinien kertymistä yhdessä proteolyysi-entsyymien lisääntymisen kanssa, mikä on yllättävää ja epätavallista. He kirjoittivat:

“Ubiquitinoitujen proteiinien kertymistä yhdessä lisääntyneen oletetun proteasomiaktiivisuuden kanssa havaittiin ABPP: [Toimintaperusteinen proteiiniprofilointi] kautta, mikä osoittaa proteasomin roolin herbisidikäsittelyssä. Ubikvitinoitujen proteiinien kertyminen on tyypillisesti kuvattu yhdessä samanaikaisen laskun kanssa Tästä huolimatta tuloksemme osoittivat nousuja sekä proteasomissa substraattitasoissa että aktiivisuuksissa. Täten herbisidien aiheuttama proteiinin aiheuttama stressi voi johtaa ubiquitinoitujen proteiinien kertymiseen, huolimatta lisääntyneestä proteasomisesta aktiivisuudesta tai substraatin lisääntyneestä saatavuudesta. indusoi proteasomeja.”

Todennäköinen selitys on, että proteiineihin upotettu glyfosaatti häiritsee proteolyyttisten entsyymien kykyä hajottaa sitä. Itse asiassa paperissa, joka yhdistää glyfosaatin amyotrofiseen lateraaliskleroosiin (ALS), kuvasimme kuinka glyfosaatti voisi häiritä ubikvitinointiprosessia, mikä merkitsee proteiineja proteasomin poistoon [4]. Me kirjoitimme:

“Mielenkiintoisinta on se, että ubikitiini itsessään riippuu kriittisesti erittäin konservoituneesta karboksiterminaalisesta kaksiglysiiniparista rakentaakseen monimutkaisia ubikitiiniketjuja, jotka ilmoittavat proteiinista hajoamiseksi [46] [jäljempänä tässä [5]]. Glyfosaatin korvaaminen Näiden välttämättömien glysiinien odotetaan heikentävän väärin laskostuneiden proteiinien kierrätysprosessia. Tämä voisi helposti selittää väärin laskostuneiden proteiinien kertymisen, joka on ALS: n tunnusmerkki.”

Meille onneksi Antoniou et ai. [1] tarjosivat taulukkoonsa 3 tarkat sekvenssit, jotka havaittiin glyfosaattisubstituutioilla, ja Uniprot-verkkosivusto tarjoaa työkalun, josta voidaan löytää proteiineja, jotka sisältävät spesifisiä sekvenssejä, käyttämällä ohjelmistoa nimeltä BLAST. Uniprot pystyi hakemaan kaikkien niiden kuvion 3 osumina toimitettujen 15 proteiinin identiteetin tarkalla vastaavuudella jokaisessa proteiinissa läsnä olevan sekvenssin kanssa. Kaikki 15 proteiinia olivat ihmisen proteiineja. Ainakin yhdeksän näistä proteiineista sitoutuu fosfaattia sisältäviin molekyyleihin, kuten taulukossa 1 on lueteltu. Tämä antaa tukea ajatukselle, että fosfaattia sitovat proteiinit ovat erityisen alttiita glyfosaattisubstituutioille, kuten ilmaistaan ​​äskettäisessä julkaisussa, jonka julkaisija on Gunatilake et ai. [6] ehdottaa, että glyfosaatti on tärkeä tekijä tuntemattoman etiologisen kroonisen munuaissairauden (CKDu) kannalta Sri Lankan maatalouden työntekijöiden keskuudessa. Itse asiassa proteiinien EPSP-syntaasi kasveissa, joiden uskotaan olevan glyfosaatin pääkohde rikkakasvien hävittämisessä, sisältää erittäin konservoituneen glysiinitähteen paikassa, jossa fosfoenolipyruvaatti (PEP) sitoutuu. DowDupontin tutkijat ovat pystyneet käyttämään CRISPR-tekniikkaa maissikannan luomiseen, joka on resistentti glyfosaatille, koska CRISPR-modifioitu geeni on tarkoitettu EPSP-syntaasille [7]. Ensimmäinen vaihe, jonka he tekivät, oli muuttaa DNA-koodia korvaamaan glysiini PEP: n sitoutumiskohdassa alaniinilla. Tämä johti entsyymin versioon, joka oli täysin herkkä glyfosaatille.

Taulukko 1: Yhdeksän proteiinia, jotka sisältävät glyfosaattisubstituoituja peptidejä, jotka on tunnistettu käyttämällä Tandem massalappu (TMT) -spektrometriatyökaluja. Nämä peptidit yhdessä 6 muun kanssa löydettiin viljelmässä kasvatetuista syöpäsoluista. Kaikki yhdeksän sitoutuvat fosfaattia sisältäviin molekyyleihin, kuten kolmannessa sarakkeessa on osoitettu. Ensimmäinen sarake tarjoaa havaitun sekvenssin, jossa “*” osoittaa glysiinitähteen, jonka todettiin olevan substituoitu. Katso: Antoniou et ai. (2019) saadaksesi lisätietoja kokeellisesta asennuksesta.

Kaiken kaikkiaan taulukko 1 paljastaa kiehtovan luettelon ihmisen proteiineista, ja monien niistä odotetaan ilmentyvän rintasyöpäsoluissa. Yksi on esimerkiksi RNA-metylaatioproteiini (tRNA (guaniini(10)-N2)-metyylitransferaasin homologi). Toisella on tuumorinvaimennustoiminto Akt-estämisen kautta sitoutumalla fosfatidyylinositolifosfaatteihin (Pleckstrinin homologiadomeenia sisältävä perhe A-jäsen 5). Toinen on G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR). Bar-Shavit et al.: N mukaan “GPCR: t säätelevät monia kasvaimengeneesin piirteitä, mukaan lukien immuunisolujen välittämät toiminnot, proliferaatio, tunkeutuminen ja selviytyminen sekundaarikohdassa”. [8] Toinen hitti on homeobox-proteiini, ja tämän proteiiniluokan uskotaan erityisesti olevan syy-rintasyöpään [9].

Toinen tärkeä löytö tästä paperista on kaksi proteiinia, joiden havaittiin olevan tilastollisesti merkitsevästi ylennettynä vasteena kuuden päivän glyfosaattihoitoon. Näitä ovat: ADP/ATP-nukleotiditranslokaasi (ANT) ja seriini/arginiinirikas risteytymistekijä 6 (SRSF6) [1]. Nämä kaksi proteiinia osoittautuvat erittäin mielenkiintoisiksi, koska molempien tiedetään olevan yli-ilmentyneitä kasvainsoluissa, ja molemmissa tapauksissa näiden proteiinien korkeammat pitoisuudet liittyvät heikkoon lopputulokseen syöpäpotilailla.

SRSF6 on silmukointitekijöiden perheen jäsen, jolla on voimakkaat kyky muuttaa proteiiniekspressiota modifioimalla kuinka peptidit kootaan yksittäisistä eksoneista. SRSF6: n yliekspressio keuhkojen epiteelisoluissa lisäsi proliferaatiota, suojasi niitä kemoterapialta ja lisäsi niiden kykyä muodostaa kasvaimia [10]. Lisäksi SRSF6: n kaatuminen keuhkosyövän ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa vähensi niiden kasvainten potentiaalia. SRSF6 ilmenee usein ihosyövässä, ja se muuttaa tenassiini C: n nimisen proteiinin silmukointia edistääkseen invasiivista ja metastaattista syöpää [11]. SRSF6 aiheuttaa myös keratinosyyttien liiallista proliferaatiota, psoriasikselle tyypillistä piirrettä [12]. Jos glyfosaatti aiheuttaa SRSF6: n ylenemistä rintasyöpäsoluissa, se todennäköisesti aiheuttaa tehostettua tuumorigeneesiota altistuilla ihmisillä.

ANT: tä on useita erilaisia ​​isoformeja, joilla on erilaisia ​​vaikutuksia solubiologiaan, mutta yksi, joka ilmentyy voimakkaasti rintasyöpäsoluissa, on ANT2, ja sen on osoitettu olevan tärkeä kasvaimen selviytymisen ylläpitämisessä. ANT2: n tehtävänä on kuljettaa ATP mitokondrioihin, ja tämä toiminta on tärkeää, kun solu toimii Warburg-vaikutelman oletuksissa. Syöpäsolut tuottavat paljon niiden ATP: tä sytoplasmassa glykolyysin kautta, ja sitten ANT2 kuljettaa ATP: n mitokondrioihin, jotta ne voivat vähentää tuottamansa ATP: n määrää oksidatiivisella fosforylaatiolla. Tämä on hyvä strategia suojaamiseksi hapettumiselta aiheutuvilta vaurioilta, etenkin kun mitokondriat voivat olla toimintahäiriöitä toksisista altistumisista johtuvien DNA-mutaatioiden vuoksi. ANT2 itse asiassa ohjelmoi solun toteuttamaan strategioita, jotka johtavat lisääntyneeseen lisääntymiseen kuin apoptoosiin (solukuolemaan) stressitekijöiden läsnäollessa [13]. Viime aikoina on ollut kiinnostusta kehittää lääkkeitä, jotka torjuvat syöpää torjumalla ANT2-aktiivisuutta [14].

The Antoniou et ai. paperi voi olla merkittävä läpimurto pyrkimyksessämme löytää menetelmä proteiinien glyfosaattikontaminaation havaitsemiseksi. On huomattavaa, että he kykenivät tunnistamaan 15 ihmisen proteiinia, jotka näyttävät olevan modifioituja glyfosaattisubstituutiolla spesifiselle glysiinitähteelle. Paperi on arvokasta koko yhteisölle, koska se määrittelee määrätyn menettelyn, jota voidaan nyt soveltaa melko rutiininomaisesti moniin muihin viljelmässä kasvatettuihin solutyyppeihin, sekä biologisiin näytteisiin, jotka on otettu nisäkkäiden sairaista kudoksista, kuten kynnet sklerodermiapotilaiden, psoriasispotilaiden ihosolut, autististen lasten hiusnäytteet, hevosten sormet, jotka kärsivät perustajasta, kasvainbiopsiat, Alzheimerin plakin jälkeinen kuolema, sairaat munuais- ja maksakudokset jne.

Tulevia mahdollisuuksia löytää glyfosaatin saastuttamia proteiineja on runsaasti, ja kun keräämme tietokantaa erityisistä substituutiokuvioista, voimme ehkä jopa ennustaa sääntöjä peptidikonteksteille, joissa glysiinitähteet ovat erityisen alttiita, esimerkiksi kun naapurimaiden aminohapot ovat pieniä (estääkseen) steerinen este) tai positiivisesti varautunut (glyfosaatin houkuttelemiseksi peptidikokoelmaan sen negatiivisen varauksensa takia). Tämän tyyppiset säännöt todellakin ilmestyvät jo pienessä sarjassa, joka on haettu julkaisusta Antoniou et al. koe. Kuuteen 15 väitetystä substituoidusta glysiinistä seurasi välittömästi positiivisesti varautunut aminohappo (lysiini, histidiini tai arginiini). Ja kymmentä edelsi heti yksi valiinista, leusiinista, seriinistä tai treoniinista, jotka kaikki ovat pieniä aminohappoja, jotka tukevat tilaa glyfosaatin metyylifosfonyylipäähän. Jos glyfosaatti todellakin korvaa glysiinin proteiinisynteesin aikana, seuraukset ovat mielenkiintoisia, ja glyfosaatin salakavalat kumulatiiviset toksiset vaikutukset voivat helposti selittää nousun, jonka tänään näemme, autoimmuunisairauksien, metabolisten, neurologisten ja onkologisten sairauksien pitkän luettelon esiintyvyydessä.

Viitteet

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Nettilinkki)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Nettilinkki) (Download)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Nettilinkki)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Nettilinkki) (Download)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Nettilinkki)
[6] S Gunatilake et al. Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Nettilinkki) (Download)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Nettilinkki)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Nettilinkki)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Nettilinkki)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Nettilinkki)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Nettilinkki)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Nettilinkki)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Nettilinkki)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Nettilinkki)

Korvaako glyfosaatti glysiiniä nisäkässolujen aktiivisesti jakavien proteiinien proteiineissa? kirjoittanut Stephanie Seneff on lisensoitu a Creative Commons Attribution 3.0 United States License.